生化學 - 生化技術

蛋白質純化方法 (Protein Purification Methods)

親和力層析法 (Affinity Chromatography)

• 原理: 利用目標蛋白質與其 特異性配體 (ligand) 之間的高度 專一性結合 進行分離。
• 範例: 酵素與其 受質、抗體與其 抗原、受體與其 配體。
• 特點: 通常能一步達到很高的 純化效果，專一性高。

金屬螯合親和層析 (IMAC)

• 原理: 屬於 親和力層析法 的一種。
• 機制: 利用 鎳離子 (Ni2+) 與蛋白質上特定的 組胺酸 (histidine) 殘基具有強親和力。
• 應用:
  • 用於純化帶有 His-tag (polyhistidine tag) 的目標蛋白。
  • His-tag 通常由多個連續的 組胺酸 (常為 6 個) 組成，透過 基因工程 技術添加至目標蛋白的 N 端 或 C 端。
  • His-tag 能與層析介質上固定的 Ni2+ 離子 特異性結合，從而將目標蛋白從混合物中分離。

離子交換層析法 (Ion-exchange Chromatography)

• 原理: 根據蛋白質的 淨電荷差異 進行分離。

膠體過濾層析法 (Gel Filtration Chromatography / Size Exclusion Chromatography, SEC / 分子篩層析法)

• 原理: 根據分子 大小 (molecular size) 進行分離。
• 機制:
  • 使用含有 多孔珠粒 (porous beads) 的層析管柱。
  • 較大的分子: 無法進入珠粒孔洞，沿空隙快速通過，最先被洗脫 (elute)。
  • 較小的分子: 可進入珠粒孔洞，停留時間較長，較晚被洗脫。
  • 最終依 分子大小 順序（從大到小）分離。
• 限制: 僅提供蛋白質的 分子量 資訊，無法直接鑑定 蛋白質身份。

鹽析法 (Salting-out)

• 原理: 利用 高鹽濃度 降低蛋白質溶解度，使其 沉澱。
• 特點: 是一種 粗略的分離方法，專一性最低。

選殖載體 (Cloning Vector)

• 定義: 用於將外源 DNA 片段 導入宿主細胞並進行複製的 DNA 分子。

各類選殖載體承載能力比較

蛋白質分析技術 (Protein Analysis Techniques)

蛋白質身份鑑定 (Protein Identification)

• 目的: 確定一個未知蛋白質的種類或名稱。
• 常用方法:
  • 西方墨點法 (Western blot)
    • 原理: 利用 特異性抗體 識別目標蛋白質。
    • 應用: 確認蛋白質的 存在 和 分子量。
  • 質譜法 (Mass Spectrometry)
    • 原理: 測量蛋白質或其片段的 精確質量。
    • 應用: 透過比對資料庫來 鑑定蛋白質。
  • 胺基端序列分析 (N-terminal Sequencing) (例如 Edman degradation)
    • 原理: 直接測定蛋白質 N 端 的 胺基酸序列。
    • 應用: 進而 鑑定蛋白質。
• 無法直接鑑定身份的方法:
  • 膠體過濾層析法 (Size Exclusion Chromatography, SEC): 僅提供 分子量 資訊，無法直接鑑定 蛋白質身份。

蛋白質分子量測定 (Protein Molecular Weight Determination)

凝膠電泳法 (Gel Electrophoresis)

• 定義: 分離生物大分子的技術。

十二烷基硫酸鈉聚丙烯醯胺凝膠電泳 (SDS-PAGE)

• 最常用且可靠 的蛋白質分子量測定技術。
• 原理:
  • SDS (十二烷基硫酸鈉):
    • 強效陰離子去污劑。
    • 變性蛋白質: 破壞蛋白質的 非共價鍵，使其 完全變性，失去 二級、三級、四級結構，展開成 線性多肽鏈。
    • 賦予均勻負電荷: 以約 1.4克SDS/克蛋白質 的恆定比例結合，使所有蛋白質帶上大量 負電荷，且電荷量與 蛋白質質量成正比 (或電荷與質量比大致相同)。
  • 在電場中，帶負電荷的蛋白質向 正極 移動。
  • 在 聚丙烯醯胺凝膠 中，蛋白質依 分子大小 分離：
    • 小分子 移動快。
    • 大分子 移動慢。
• 應用: 透過與已知分子量的 標準品 (molecular weight markers) 比較，準確估算 未知蛋白質的 分子量。

蛋白質與蛋白質交互作用 (Protein-protein interaction, PPI)

• 定義: 細胞內許多生物過程的基礎。
• 分析方法:
  • 免疫共沉澱法 (Co-immunoprecipitation, Co-IP)
  • 酵母菌雙雜交測定 (Yeast two-hybrid assay, Y2H)
  • 串接親和共純化 (Tandem affinity purification, TAP)
• 非直接交互作用分析:
  • 免疫組織化學染色法 (Immunohistochemical staining, IHC): 主要用於檢測組織或細胞中特定蛋白質的 表達水平 和 細胞內定位，不能直接證明 蛋白質之間的物理交互作用。

蛋白質光學性質與定量 (Protein Optical Properties & Quantification)

• 特徵吸收峰: 蛋白質在紫外光區 (UV light) 有特徵性的吸收峰，最常用於定量的是 280 nm 波長。
• 吸收來源: 主要歸因於蛋白質中含有芳香族側鏈的胺基酸：色胺酸 (tryptophan)、酪胺酸 (tyrosine) 和 苯丙胺酸 (phenylalanine)。
• 貢獻度:
  • 色胺酸 (tryptophan): 在 280 nm 處的摩爾消光係數最高，對蛋白質吸光值貢獻最大。
  • 酪胺酸 (tyrosine): 也有顯著貢獻。
  • 苯丙胺酸 (phenylalanine): 貢獻相對較小。
• 應用: 蛋白質樣品在 280 nm 處的吸光值與其 色胺酸 和 酪胺酸 含量成正比，可用於估算 蛋白質濃度。

免疫分析技術 (Immunoassays)

放射免疫分析法 (Radioimmunoassay, RIA)

• 發明者: Rosalyn Yalow 和 Solomon Berson (1950年代末期)。
• 最初應用: 測量血漿中的 胰島素 (insulin) 濃度 (胜肽賀爾蒙)。
• 原理: 基於 抗原-抗體反應 的 競爭性結合。
  • 使用 放射性標記的抗原 與 未標記的待測抗原 競爭結合 有限數量的抗體。
• 特點:
  • 高度敏感 且 專一性高 的體外檢測方法。
  • 能測量體液中 極低濃度 的生物活性物質。
• 應用範圍:
  • 賀爾蒙 (如 胰島素、其他 胜肽賀爾蒙、類固醇賀爾蒙、甲狀腺賀爾蒙)。
  • 藥物、病毒抗原 等。
• 重要性: 極大推動了 內分泌學 的發展，尤其在 胜肽賀爾蒙 測量方面。

DNA足跡鑑定 (DNA footprinting assay)

• 目的: 精確定位 DNA 上與特定 蛋白質 結合的區域。
• 原理:
  • 將 DNA 片段 與欲研究的 蛋白質 混合，使蛋白質結合到 DNA 上。
  • 使用 核酸酶 (如 DNase I) 隨機切割 DNA。
  • 蛋白質結合的區域 會受到保護，不會被核酸酶切割。
  • 透過 電泳分析，該區域會呈現出一個「空白 (blank)」或「足跡 (footprint)」，從而揭示蛋白質的 結合位點。

多聚核苷酸激酶 (Polynucleotide Kinase, PNK)

• 功能: 將 ATP 的 磷酸基團 轉移至 DNA 或 RNA 的 5' 羥基末端。
• ATP 磷酸基團: 包含 α、β、γ-磷酸。
• 轉移機制: PNK 催化將 ATP 的 γ-磷酸 轉移到核酸的 5' 端。
• 應用: 若需在核酸 5' 端標記放射性磷酸，應使用 γ-32P-ATP (或針對 DNA 使用 γ-32P-dATP)。

聚合酶鏈鎖反應 (Polymerase Chain Reaction, PCR)

• 定義: 一種在體外（試管中）快速放大特定 DNA 片段 的技術，廣泛應用於 分子生物學 和 醫學診斷。
• 能量來源: 透過 dNTPs 本身的高能磷酸鍵水解提供能量，不需額外 ATP。
• 過程: 主要透過 溫度循環 控制 DNA 變性、引子退火 和 DNA 延伸。

核心物質 (Core Components)

• DNA 雙股模板 (template): 提供要複製的目標 DNA 序列。
• 引子 (primer):
  • 兩段短的單股 DNA 序列，與模板 DNA 的兩端互補，作為 DNA 聚合酶 合成的起點。
  • 需具 高度特異性，以確保準確結合目標序列。
  • 設計良好的引子僅擴增 單一目標位點；若特異性不足，可能導致 非特異性產物。
• 去氧核糖核酸聚合酶 (DNA polymerase): 通常使用耐熱的 Taq 聚合酶，負責合成新的 DNA 鏈。
• 去氧核糖核苷三磷酸 (dNTPs): 包括 dATP, dCTP, dGTP, dTTP，是合成新 DNA 鏈 的原料（建材）。本身帶有 高能磷酸鍵，其水解釋放能量。
• 鎂離子 (Mg2+): 作為 DNA 聚合酶 的 輔因子 (cofactor)，對酵素活性和反應效率至關重要。
• 緩衝液 (buffer): 提供適合酵素反應的環境。

基因工程與分子操作技術 (Genetic Engineering & Molecular Manipulation Techniques)

細菌轉形 (Bacterial Transformation)

• 定義: 細菌直接從環境中攝取 外源 DNA 的過程。
• 目的: 在實驗室中，提高細菌攝取 質體 (plasmid) DNA 的效率。
• 常用方法:
  • 化學轉形法 (Chemical Transformation):
    • 機制:
      • 使用 氯化鈣 (CaCl2) 處理，中和 細胞膜和 DNA 上的 負電荷，使細胞膜變得 通透。
      • 接著進行 熱休克 (heat shock) (例如從 冰浴 迅速轉移到 42°C，再回到 冰浴)，暫時改變細胞膜流動性，形成小孔，使 質體 DNA 進入細胞。
  • 電穿孔法 (Electroporation):
    • 機制: 利用 高壓電脈衝 在細胞膜上形成 暫時性小孔，讓 DNA 進入。
• 不常用於細菌轉形的方法:
  • 噬菌體轉染法 (Transfection): 主要用於將 DNA 導入 真核細胞，或將 病毒 DNA 導入細菌。
  • 微注射法 (Micro-injection): 對於細菌操作難度大且效率低。

基因定點突變 (Site-Directed Mutagenesis)

• 目的: 在特定的 DNA 序列 上引入 精確、預先設計好的突變。
• 常用方法: 以 聚合酶鏈鎖反應 (PCR) 為基礎的技術，例如 QuikChange 突變法。
• 核心要素:
  • 質體 DNA (plasmid DNA): 含有目標基因的 模板 DNA。
  • 合成引子 (mutated primers): 帶有目標突變序列，與模板 DNA 結合並引入突變。
  • DNA 聚合酶 (DNA polymerase): 需具備 高保真度 且 不具鏈置換活性，用於延伸引子並合成新的 DNA 鏈。
  • 去氧核糖核苷三磷酸 (dNTPs): 作為 DNA 合成原料。
  • DNA 連接酶 (DNA ligase) (部分方法需要)。
  • 限制酶 (restriction enzyme) (部分方法需要)。

DNA 熱變性與光學性質 (DNA Denaturation & Optical Properties)

DNA 融化溫度 (Melting Temperature, Tm)

• 定義: 雙股 DNA 受熱解旋成單股 DNA 時，一半 DNA 已經解旋 的溫度。

DNA 紫外光吸收特性

• 低色度 (Hypochromicity):
  • 現象: 雙股 DNA 的 核鹼基 因 堆疊效應，其吸收 260 nm 紫外光 的能力比相同濃度的單股 DNA 弱。
• 高色度效應 (Hyperchromicity Effect):
  • 現象: 當雙股 DNA 受熱解旋成單股 DNA 時，核鹼基 堆疊結構被破壞，對 260 nm 紫外光 的吸收能力會顯著增加 (約 30-40%)。
• 應用: 可透過監測 260 nm 波長 處的紫外光吸收度隨溫度變化的曲線，來測定 DNA 的 Tm。

核酸分析與交互作用技術 (Nucleic Acid Analysis & Interaction Techniques)

RNA 定量技術 (RNA Quantification Techniques)

• 目的: 測定細胞中特定 RNA 的數量。
• 常用方法:
  • RNA 深度定序 (RNA deep sequencing, RNA-seq): 可同時測定大量 RNA 的表達量。
  • RNA 微陣列 (RNA microarray): 可同時測定大量 RNA 的表達量。
  • 反轉錄－即時聚合酶鏈鎖反應 (RT-qPCR):
    • 高靈敏度 且 精確 的 單一或少量 RNA 定量方法。
    • 原理: 先將 RNA 反轉錄成 cDNA (此步驟需使用 反轉錄酶)，再進行 qPCR 放大與定量。

蛋白質與核酸交互作用分析 (Protein-Nucleic Acid Interaction Analysis)

• 核糖核酸免疫沉澱 (RNA Immunoprecipitation, RIP)
  • 目的: 研究 RNA 結合蛋白 (RNA-binding proteins, RBPs) 與其結合的 RNA 序列。
  • 機制: 利用 抗體 沉澱特定的 RNA 結合蛋白，再分離並分析與該蛋白結合的 RNA。
  • 特點: 主要用於研究 蛋白質-RNA 相互作用，非直接定量 細胞中某一特殊 RNA 的總量。

DNA 分析技術 (DNA Analysis Techniques)

• 限制性片段長度多態性 (Restriction Fragment Length Polymorphisms, RFLPs)
  • 原理: 利用 限制酶 切割 DNA 後，比較不同個體 DNA 片段長度差異。這些長度差異源於 DNA 序列 中 限制酶辨識位點 的 有無或位置變化 (即 限制酶切位點變異)。
  • 應用: 作為 遺傳標記，用於 DNA 指紋鑑定 (個體識別、親子鑑定)、疾病基因定位、遺傳缺陷的產前篩選 等。
  • 偵測方法:
    1. 限制酶切割 DNA 樣本。
    2. 凝膠電泳 分離不同長度片段。
    3. 使用 南方墨點法 (Southern blotting) 偵測目標片段。
  • 注意: cDNA 文庫 的建立是將 mRNA 反轉錄成 cDNA 並插入載體，與 RFLP 分析 的原理和目的完全不同。
• 南方墨點法 (Southern blotting)
  • 目的: 偵測 特定 DNA 序列。
  • 機制:
    1. 將 電泳分離 後的 DNA 片段 轉移至 膜 (membrane) 上。
    2. 使用 標記的 DNA 探針 (labeled DNA probe) 進行 雜交 (hybridization)，以識別目標序列。
• 桑格定序法 (Sanger Sequencing / Dideoxy Chain-Termination Method)
  • 目的: 確定 DNA 序列。
  • 關鍵試劑: 2', 3'-雙脫氧核苷酸 (ddNTPs)。
  • ddNTPs 特點:
    • 與正常 去氧核苷酸 (dNTPs) 結構相似。
    • 關鍵差異: 在 2' 和 3' 碳原子 上都缺少 羥基 (-OH)。
  • 作用機制:
    • 當 DNA 聚合酶 合成 DNA 鏈 時，若摻入 ddNTPs。
    • 因 ddNTPs 缺少 3'-OH 基團，無法形成 磷酸二酯鍵。
    • 導致 DNA 鏈延伸終止 (chain termination)。
  • 實驗設計: 在不同反應中分別加入少量 ddATP, ddCTP, ddGTP, ddTTP。
  • 結果: 產生一系列不同長度的終止片段，藉此推斷出 DNA 序列。